王貞仁 教授 |
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Jen-Ren Wang. Ph. D. |
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辦公室電話: | 5785 |
辦公室地點: | 醫技系四樓5786室 |
電子信箱: |
jrwang@mail.ncku.edu.tw |
學術成大: |
王 貞仁 |
Publons: |
Jen-Ren Wang |
本實驗室一直以來致力於病毒流行監控、基因體資料建立及致病機轉與毒力研究,主要著重於流感病毒、腸病毒A71型及登革熱病毒之研究,期望藉由找出可能的毒力決定因子與造成流行的原因,降低病毒造成的威脅。
流行性感冒病毒研究 (Influenza virus):
流行性感冒病毒每年在全球造成不同程度的疫情,在人類歷史上一直扮演重要且令人聞之色變的角色。人類流行性感冒主要由A及B型流感病毒所引起,常因基因突變或是片段重配而引起大流行,因此長期且不間斷之監測是相當重要。我們實驗室每年來針對流感病毒進行持續性監測並探討病毒複製,並且分析這些病毒分離株之基因型及抗原變異。台灣每年國人會依據WHO建議施打三或四價流感疫苗。由於流感病毒具有高度突變的特性,WHO每年會評估過去流行狀況、臨床病毒株親緣及抗原演化結果,因而選出下一季流感季疫苗株。但東南亞及東亞地區之流感病毒已知為全球流感病毒株之源起,因此在疫苗株決定之時,其類似株通常已在東南亞與東亞區域間造成流行。因此我們利用血凝抑制試驗 (Hemagglutination inhibition test),持續探討台灣當季流行病毒株與疫苗選株,在抗原特性上之差異程度,希望能對於疫苗政策提供重要資訊。
除此之外,我們對流感病毒基因演化及變異對病毒特性及致病機轉亦相當有興趣。例如:在流感病毒的八段負股的基因片段中,核蛋白 (NP)具有多種功能,可以形成同源寡聚體(homo-oligomers)、包裹住病毒RNA片段來維持構造穩定、並參與在病毒的複製和轉錄。為了瞭解NP在病毒演化上的貢獻,我們分析了1999至2017年A型流感主要流行的亞型H3N2的臨床病毒株,並從中找出核蛋白基因的突變點。為了瞭解這些突變點所帶來的影響,我們利用微基因體實驗(mini-genome assay)來檢測病毒的聚合酶活性。在展現最高聚合酶活性的病毒株中,我們發現了在核蛋白上位於頭區(head domain)和主體區(body domain)上有兩個位點會去影響病毒生長特性,並可能在病毒演化中的上位關係(epistasis)扮演角色。
腸病毒A71型病毒研究 (Enterovirus A71):
1. 病毒演化與變異 (Enterovirus A71 evolution and genetic variations)
自1998年大流行之後,2008年及2012年台灣腸病毒A71型出現兩次大規模流行,分析病毒全長基因序列後,發現主要變異在非結構蛋白。中國腸病毒A71型演化亦發現胺基酸逐年變異主要出現在非結構蛋白區域,分析荷蘭腸病毒A71型疫情,觀察到以階梯式演化累積病毒變異的現象,其主要演化變異亦發生在非結構蛋白上。以往腸病毒系統演化研究中認為主要的演化變異可能在結構蛋白區域,而我們的研究主要著重在病毒全長基因分析,此研究意外發現非結構蛋白區域胺基酸之變異,在演化中對於基因型再度流行扮演重要角色。
2. 抗原圖譜 (Antigenic map)
台灣腸病毒A71型於1998年爆發大流行,自此約3至5年就會出現一波大流行,主要流行基因型在C型及B型之間變化。經序列及演化樹分析發現1998年流行病毒株以基因型C2為主,1998至2002年間,主要流行的基因型為B4,2004-2005年間,主要流行又轉變為基因型C4,而2008年出現B5基因型為主之大規模流行,從B到C或C到B的基因型變化至少發生三次,藉由中和試驗繪製EV-A71抗原圖譜,發現B5基因型病毒株之抗原特性與基因型B4及C分成了不同群。許多研究指出,抗體免疫反應是主要保護宿主對抗病毒的方式。病毒因受到宿主體內之中和抗體的壓力而產生突變,若這些突變位在病毒之殼蛋白 (capsid protein),便會影響病毒之抗原性 (antigenicity),因此,腸病毒A71型抗原性之研究在致病機轉的探討或疫苗研發上皆可提供重要訊息。
3. 抗原決定位 (Antigenic Determinants)
本研究為瞭解不同基因型其基因差異與抗原特性間的關聯,進行EV-A71基因型B4和B5病毒株序列比較,發現外殼蛋白(capsid)共有4個胺基酸的差異,其中外殼蛋白VP1-98, VP1-145, VP1-164位點座落於病毒顆粒表面。由病毒模擬結構圖發現,VP1-145和VP1-164位點鄰近腸病毒A71型受體結合蛋白PSGL-1和SCARB2的受體結合位點VP1-244, VP1-166, VP1-172,其中位點VP1-98被認為和病毒與細胞結合有關。進一步利用位點突變病毒評估病毒對宿主細胞的結合能力,結果發現VP1-98, VP1-145, VP1-164三個位點的突變會影響病毒結合至宿主細胞及改變病毒的抗原特性。結果顯示,VP1-98K/145Q/164E突變會影響病毒結構,增強病毒結合至宿主細胞的能力,此為腸病毒A71型抗原決定位置提供了重要訊息,持續監控病毒基因及抗原變化對於疫苗發展之影響力不容忽視。
4. 病毒毒力決定因子 (virulence determinant)
a. 5’UTR-U158C
比較EV-A71小鼠非馴化株病毒237與4643毒力,我們發現病毒株4643在人體中會造成嚴重疾病,但僅對新生小鼠具有毒力,而病毒株237雖是輕症患者分離之病毒株卻會造成小鼠死亡。研究結果發現將5端非轉譯區第158個核酸位置由1986年的臨床病毒株237的C置換成1998年的臨床病毒株4643的U時,病毒毒性顯著降低,感染小鼠的存活率與平均存活天數顯著升高,顯示5端非轉譯區第158個核酸位置可能為一影響病毒對小鼠毒力之毒力決定位置。目前雖有許多研究探討EV-A71的毒力決定位置,但那些研究使用的EV-A71大都是利用細胞或動物馴化後的病毒株,因此均得到類似的結果:病毒結構蛋白的基因改變決定其馴化後的毒性。本研究利用非馴化臨床病毒株的5端非轉譯區序列進行研究,所找出的158位點不但是EV-A71研究中第一個利用非馴化病毒株進行研究所得到的結果,也是在5端非轉譯區所發現的第一個EV-A71毒力決定位置。
b. 3D-T251I
腸病毒A71型於1998年爆發大流行,並造成78人死亡,在此之前雖有出現零星感染案例,但未出現致死案例,因此我們比較了1998年重症病毒分離株及1986年輕症病毒分離株之胺基酸序列。過去研究發現3D聚合酶對於腸病毒的複製調控扮演重要角色,比較兩病毒株的3D胺基酸序列後發現有單點胺基酸的突變,此突變導致病毒生長對溫度敏感性,且改變病毒對小鼠的毒性,結果發現3D - I251T突變可能有助於降低病毒毒力,增加病毒適應性,顯示此位點可能為病毒毒力決定位置,此結果顯示,1998年病毒株在高溫長得較好,病毒量較高,也較容易造成重症。
c. VP1- Q145E and VP2-K149M
比較EV-A71小鼠馴化株MP4與非馴化株4643毒力差異的機制,發現MP4與非馴化株病毒相比具有較高的感染力,對神經細胞會造成較高的細胞毒性,對新生小鼠也會造成較高的死亡率。比對其序列並藉由重組病毒研究病毒基因片段置換對細胞毒性、LD50的結果,顯示結構蛋白是決定其細胞毒性與小鼠存活的區域。帶有VP2-149M或VP1-145E的病毒株可產生較高的病毒效價與細胞凋亡。而兩個胺基酸變異同時存在時,可以共同作用加強病毒與Neuro-2a細胞的結合及病毒RNA堆積,增加感染新生小鼠時的死亡率。VP2-149M與VP1-145E位點變異會影響病毒感染力及小鼠存活率。此研究不但找出馴化病毒株毒力變異的決定位置,也進一步瞭解其影響的機制。
d. VP1-D31G
分析成大醫院1998年收取之死亡案例檢體,由7個不同組織檢體分離病毒,並利用次世代定序進行病毒準種(quasispecies)組成分析,發現從周邊組織到中樞系統組織分離之病毒,其病毒準種內的主要單倍體(haplotype) 有明顯的差異。利用網絡分析圖,依照病毒單倍體出現頻率,以相對應大小的圓圈表示,進一步驗證病毒單倍體與不同組織的關聯,發現病毒主要有兩種單倍體,並在不同組織中佔了相當高的比例。比較兩個主要單倍體序列發現只有外殼蛋白VP1-31位點為非同義突變,並隨著病毒從呼吸道、消化道至中樞系統,從天冬氨酸(D) 變成甘氨酸(G),我們認為這是瓶頸效應的選擇壓力造成,病毒入侵後其感染途徑驅動了單倍體組成的轉變,VP1-31G突變使病毒更容易感染中樞神經系統。研究結果顯示病毒感染呼吸道、消化道及中樞系統過程中,為適應不同環境造成的選擇壓力會產生單倍體的改變,使病毒更容易感染特定組織,為病毒致病機制提供一重要見解。
登革病毒研究 (Dengue virus):
1. 登革病毒臨床檢驗方法比較與分析 (Tsai HP, et al., PLoS Negl Trop Dis. 2016. 12;10(10):e0005036.)
登革病毒每年均在台灣造成不同程度的流行,2015年台南發生第二型登革病毒的大爆發,在22,563個感染患者中有112個死亡案例 (死亡率0.5%)。登革病毒的感染可能導致疾病從無症狀到嚴重的登革出血熱與登革休克症候群,甚至死亡,因此正確快速並早期偵測登革病毒感染對於臨床照顧是非常需要的。我們分析了8989個、8954個、與1581個2015年爆發大流行時的檢體,分別進行NS1抗原、IgM/IgG 抗體、與qRT-PCR病毒量的偵測。總計有1581個檢體同時進行了NS1抗原、IgM/IgG 抗體、與qRT-PCR病毒量的偵測,其中41.8%、11.2%、6.9%、與40.2%分別為NS1、IgM、IgG、與qRT-PCR病毒量陽性。比較NS1抗原偵測與qRT-PCR病毒量 (LightMix assay),結果發現有88.9% (1405/1581)的正相關性,這兩種方法的敏感性與特異性分別為89.4與100%及84.7與100%。本研究中進一步發現重症病患中79.5%年齡為≥71歲,82.3% (14/17) 檢驗結果為 NS1/IgM/IgG (+/-/-)且病毒量為106–109 copies/mL,明顯高於其他年齡層的病患。綜合以上結果顯示,LightMix assay病毒核酸定量檢測有利於登革病毒感染的早期診斷,而對於感染的老年患者,登革病毒高病毒量將可以作為一個疾病嚴重程度及致死率的正向指標。
2. 登革病毒基因演化、病毒準種及疾病嚴重度的相關性研究
許多的研究指向疾病嚴重程度與登革病毒基因序列變異的相關性,登革病毒如其他的RNA病毒一樣,在人類身上產生擁有相近序列的群體,稱之為病毒準種。登革病毒的序列如何變化及散播的詳細機制目前仍未清楚,探討基因演化和登革病毒特性改變的關聯,有助於了解病毒的致病機轉。2015年發生在南臺灣的登革熱大爆發造成超過43,000個案例,而在台南市就超過22,000個確診案例及造成112個死亡。因此,我們挑選兩個組別的檢體 (10個輕症及12個死亡案例),用細胞株分離培養出病毒株後,以反轉錄聚合酶連鎖反應放大出登革病毒的全長基因體,然後利用次世代定序平台進行全基因體定序。該平台定序後便得到許多短序列片段 (reads) 數據,我們利用了QuasiRecomb及LoFreq兩種方法建構出每個病毒株的病毒準種,並用以比較單核苷酸多態性在來自不同組別的病毒株是否有差異。利用QuasiRecomb方法且設定p值<0.05、<0.01或<0.001的標準後,發現250、51或4個核苷酸位置在兩組間有顯著差異。另一方面,LoFreq方法且設定p值<0.05的標準後,有6個核苷酸位置在兩組間有顯著差異。接下來著重分析QuasiRecomb 方法中p值<0.001的4個及LoFreq 方法中p值<0.05的6個核苷酸變異,這10個當中有9個是位於病毒基因體中轉譯出非結構蛋白的區段,將證實基因變異和疾病嚴重度的關聯性。
Research interests
Viral pathogenesis, virus-host cell interaction, diagnostic virology, molecular epidemiology of enteroviruses and influenza viruses, virulence gene analysis of enterovirus 71 and influenza viruses.
博士班學生:黃○玲、鄭○瑋
碩士班學生: 謝○升、劉○安、蔡○遠、戴○平、沈○宇
研究助理: 戴○蕙、連○吟、洪○珍、徐○美、蔡○軒、鄭○晶
已畢業博士班學生:葉明德、黃聖文
已畢業碩士班學生:戴○蕙、洪○珍、徐○美、蔡○軒、鄭○晶、賴○雯、黃○惠
指導學生之特殊榮譽
榮譽及獎勵
無相關資料